Биологические особенности и устойчивость к фунгицидам фитопатогенного гриба Ilyonectria crassa

Е.М. Чудинова, В.А. Платонов, А.В. Александрова, С.Н. Еланский

Недавно было показано, что гриб-аскомицет Ilyonectria crassa способен поражать клубни картофеля. В работе впервые проанализированы биологические особенности и устойчивость к некоторым фунгицидам выделенного с картофеля штамма I. crassa. Последовательности видоспецифичных участков “картофельного” штамма совпали с полученными ранее для грибов, выделенных из корней нарцисса, женьшеня, осины и бука, луковиц лилии и листа тюльпана. По-видимому, многие дикорастущие и садовые растения могут быть резерватами I. crassa. Исследуемый штамм заражал ломтики томата и картофеля, но не инфицировал целый плод томата и неповрежденный клубень картофеля. Это показывает, что I. crassa является раневым паразитом. Оценка устойчивости к флудиоксонилу, дифеноконазолу и азоксистробину на питательной среде показала высокую эффективность этих препаратов.

Показатель ЕС50 (концентрация фунгицида, замедляющая в 2 раза скорость радиального прироста колонии относительно бесфунгицидного контроля) был равен 0.4; 7.4 и 4 мг/л соответственно. Возможность развития заболевания, вызываемого I. crassa, следует учитывать при фитопатологической оценке клубней картофеля и разработке мероприятий по защите растений.

Развитие фитопатогенных микроорганизмов приводит к высоким потерям на всех этапах выращивания и хранения картофеля. При планировании защитных мероприятий учитываются, как правило, хорошо известные возбудители болезней, такие как виды родов Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora и др. Однако в последние годы появляется все больше сообщений о появлении на картофеле новых фитопатогенных микроорганизмов. Их биология слабо изучена, эффективность используемых на картофеле фунгицидов в их отношении неизвестна, методы диагностики не разработаны. При массовом развитии они способны нанести ощутимый урон урожаю картофеля. Одним из таких микроорганизмов является гриб-аскомицет Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, впервые обнаруженный авторами на клубнях картофеля (Chudinova et al., 2019).

В данной работе приведены результаты анализа выделенного из клубня картофеля штамма I. crassa. Изучены морфология колоний и мицелиальных структур I. crassa, последовательности нуклеотидов видоспецифичных участков ДНК, вирулентность к картофелю и томату, устойчивость к некоторым популярным фунгицидам.

Материалы и методы

В работе использован штамм I. crassa 18KSuPT2, выделенный в 2018 году из пораженного клубня картофеля, выращенного в Костромской области. Клубень был поражен по типу сухой гнили с полостью, покрытой светло-коричневым мицелием. С помощью стерильной препаровальной иглы мицелий гриба переносили в чашку Петри с агаризованной средой (пивное сусло 10 %, агар 1.5 %, пенициллин 1000 ед/мл). Инкубировали чашки в темноте при 24 °C.

Для фотографирования, оценки размеров и морфологии спор и органов спороношения использовали световой микроскоп Leica DM2500 c цифровой камерой ICC50 HD и бинокулярный микроскоп Leica M80 с цифровой камерой IC80HD (Leica Microsystems, Германия).

Для выделения ДНК мицелий гриба наращивали в жидкой гороховой среде, после чего замораживали в жидком азоте, гомогенизировали, инкубировали в СТАВ буфере, очищали хлороформом, 2 раза промывали 70 % спиртом.

Подробно метод выделения ДНК описан в статье Kutuzova et al. (2017).

Для определения видовой принадлежности молекулярными методами и сравнения с другими известными штаммами I. crassa проводили ПЦР с праймерами, позволяющими амплифицировать видоспецифичные участки ДНК: ITS1-5,8S-ITS2 (праймеры ITS5/ITS4, White et al., 1990), участки генов b-тубулина (Bt2a/Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) и фактора элонгации трансляции 1α (tef1α) (праймеры EF1-728F/EF1-986R, Carbone and Kohn, 1999). Ампликоны нужной длины экстрагировали из геля с помощью набора CleanUp компании «Евроген». Амплифицированные участки секвенировали с использованием набора реактивов BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, USA). Полученные последовательности нуклеотидов использовали для поиска соответствия в базе данных GenBank Национального центра биотехнологической информации США (NCBI). Филогенетический анализ проводили с помощью программы MEGA 6 (Tamura et al., 2013).

Определение вирулентности проводили на целых зеленых плодах крупноплодного томата (сорт Дубрава) и клубнях картофеля (сорт Гала). Кроме того, для имитации поражения поврежденных плодов и клубней использовали дольки тех же плодов и клубней. Ломтики клубней помещали во влажные камеры, представляющие собой чашки Петри с мокрой фильтровальной бумагой на дне. На бумагу помещали предметное стекло, на которое, в свою очередь, клали ломтики клубней или плодов. Целые клубни и плоды также помещали в контейнеры, на дне которых была мокрая фильтровальная бумага. В центр ломтика (или на неповрежденную поверхность клубня или плода) помещали кусочек агара (5×5 мм) с гифами гриба после 5 дней выращивания на сусло-агаре.

Оценку устойчивости штаммов грибов к фунгицидам проводили в лабораторных условиях на агаризованной питательной среде. Изучали восприимчивость к фунгицидным препаратам Максим, КС (действующее вещество флудиоксонил, 25 г/л), Квадрис, КС (азоксистробин 250 г/л), Скор, КЭ (дифеноконазол 250 г/л) (Государственный каталог…, 2020). Оценку проводили в чашках Петри на среде сусло-агар с добавлением исследуемых препаратов в концентрациях действующего вещества 0.1; 1; 10 ppm (мг/л) (для флудиоксонила и дифеноконазола), 1; 10; 100 ppm (для азоксистробина) и на среде без фунгицида (контроль). Фунгицид добавляли в расплавленную и охлажденную до 60 °C среду, после чего среду разливали по чашкам Петри. Агаровый блок с мицелием гриба помещали в центр чашки Петри и культивировали при тем-пературе 24 °C в темноте. Через 7 суток инкубирования проводили замер диаметров колоний в двух взаимно перпендикулярных направлениях; результаты измерений для каждой колонии усредняли. Эксперименты выполняли в трёх повторностях. По результатам анализов рассчитывали показатель EC50, равный концентрации фунгицида, снижающей в 2 раза скорость радиального прироста колонии относительно бесфунгицидного контроля.

Результаты и обсуждение

На чашках Петри с сусло-агаром гриб образовывал колонии с белым хлопьевидным мицелием. Среда под мицелием окрашивалась в красно-коричневый цвет. При подсыхании среды гриб формировал споры двух типов на одиночных и агрегированных в небольшие спородохии конидиеносцах. Макроконидии вытянутые, цилиндрические, с одной-тремя септами, средняя длина 27.2 мкм с разбросом значений от 23.2 до 32.2 мкм, ширина – до 4.9 мкм (рис. 1). Средняя длина микроконидий – 14.3 мкм с разбросом значений от 10.3 до 18.1 мкм, ширина – до 4.0 мкм. Все макро- и микроморфологические признаки укладываются в диапазон варьирования вида Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).

Последовательности видоспецифичных участков ДНК (ITS, b-тубулин, TEF 1α) полностью совпали с сиквенсами ранее исследованных нами штаммов I. crassa (Chudinova et al., 2019, табл. 1). С целью изучения распространенности I. crassa в других регионах и анализа спектра поражаемых культур были проанализированы аналогичные последовательности ДНК в базе GenBank (табл. 1). Перекрытие составило от 86 до 100 %. Сиквенсы всех трех участков ДНК “картофельного” штамма I. crassa были идентичны последовательностям штаммов, выделенных с луковицы лилии и корней нарцисса в Нидерландах и из корня женьшеня в Канаде. Других штаммов I. crassa с тремя проанализированными аналогичными последовательностями в открытых базах данных нам обнаружить не удалось. Однако анализ депонированных последовательностей ITS и b-тубулина показал присутствие I. crassa на листьях тюльпана в Великобритании. Грибы с похожей последовательностью ITS были выявлены при анализе микобиоты корней осины в Канаде и бука в Италии, клубней картофеля в Саудовской Аравии (табл. 1). Результаты данного исследования показывают, что I. crassa имеет глобальное распространение и способен поражать разные виды растений.

При определении патогенности на ломтиках томата и картофеля на 5 день диаметр поражения достигал 1.5 см. При этом исследуемый штамм не инфицировал целый плод томата и неповрежденный клубень картофеля. Однако на томате наблюдалось поражение чашелистиков. Для исключения возможности контаминации из развившегося на ломтике клубня картофеля мицелия был выделен в чистую культуру изолят гриба. Он был полностью идентичен родительскому штамму. По-видимому, I. crassa является раневым паразитом.

Предпосадочная обработка семенных клубней фунгицидами позволяет снизить развитие болезней на растениях во время вегетации. Для подбора эффективных фунгицидов важно оценить, какие из них эффективны по отношению к I. сrassa. В работе изучены широко распространенные действующие вещества фунгицидов – флудиоксонил, азоксистробин, дифеноконазол. Флудиоксонил входит в состав нескольких смесевых препаратов, используемых для протравливания семян и семенных клубней перед посадкой. Флудиоксонил (препарат Максим) используется также для обработки семенных клубней перед закладкой на хранение. Дифеноконазол и азоксистробин также входят в состав ряда препаратов, используемых для обработки семенного материала, а также в состав препаратов, предназначенных для обработки вегетирующих растений (Государственный каталог…, 2020).

Изучена скорость роста I. crassa на средах (рис. 2) с разными концентрациями действующих веществ: флудиоксонила (EC50 = 0.4 ppm), азоксистробина (EC50 = 4 ppm) и дифеноконазол (EC50 = 7.4 ppm) (табл. 2). Эти препараты можно признать высокоэффективными в отношении I. crassa, так как их EC50 существенно ниже рекомендованной концентрации препарата в рабочей жидкости, используемой для обработки клубней. Согласно Государственному каталогу… (2020), концентрация флудиоксонила в жидкости для обработки клубней картофеля составляет от 500 до 1000 ppm, азоксистробина (в жидкости для обработки дна борозды) – 3750–9375 ppm, дифеноконазола (в жидкости для обработки вегетирующих растений) – 187.5–625 ppm.

Таблица 1. Сходство сиквенсов видоспецифичных последовательностей штамма 18KSuPT2 и имеющихся в базе Genbank штаммов Ilyonectria crassa

НД = не депонировано

Таблица 2. Устойчивость Ilyonectria crassa к фунгицидам

В нашей работе штаммы I. crassa были выделены с клубней картофеля в Костромской и Московской (Chudinova et al., 2019) областях. Высокая доля штаммов грибов с сиквенсами ITS, идентичными I. crassa, была выявлена при анализе микобиоты клубней картофеля в Саудовской Аравии (Gashgari, Gherbawy, 2013). По-видимому, I. crassa встречается на картофеле не так редко, как может показаться. В наших экспериментах показано, что гриб мог поражать поврежденные плоды томата. Из литературных данных известно, что I. crassa способен развиваться в почве сапротрофно (Moll et al., 2016), а также поражать самые разные растения, даже такие далёкие в таксономическом плане, как нарциссы, лилии, женьшень, осина, бук (табл. 1). По-видимому, многие дикорастущие и садовые растения могут быть резерватами I. crassa. Вышесказанное показывает, что при разработке мер защиты необходимо учитывать возможность поражения клубней картофеля этим грибом. Широко распространенные препараты для обработки клубней картофеля, содержащие флудиоксонил, азоксистробин и дифеноконазол, показали высокую фунгицидную эффективность в отношении I. crassa.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 20-016-00139).

Статья опубликована в журнале «Вестник защиты растений», 2020, 103(3)