Детекция Colletotrichum coccodes с помощью ПЦР в реальном времени

Д. Ю. Рязанцев, Е. М. Чудинова, Л. Ю. Кокаева, С. Н. Еланский, П. Н. Балабко, Г. Л. Белова, С. К. Завриев

Фитопатогенный гриб Colletotrichum coccodes вызывает опасные заболевания картофеля и томата, известные как антракноз и черная пятнистость клубней. По морфологическим признакам их часто трудно отличить от заболеваний, вызываемых другими микроорганизмами; на зеленых плодах томата болезнь может протекать бессимптомно, проявляясь только на созревших красных плодах. Для быстрой и точной диагностики возбудителя предлагается тест-система для ПЦР в реальном времени. Для разработки тест-системы была определена последовательность нуклеотидов гена глицеролтрифосфатдегидрогеназы 45 штаммов C. coccodes, выделенных из клубней картофеля в разных регионах России.

На основании полученных результатов и анализа аналогичных последовательностей других видов, имеющихся в базе данных GenBank, были сконструированы видоспецифичные для C. coccodes праймеры и зонд. Для проверки специфичности созданной тест-системы проводили ПЦР с ДНК, выделенной из чистых культур 15 различных видов паразитических и сапротрофных грибов, ассоциированных с растениями томата и картофеля (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternatа, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Присутствие ДНК Colletotrichum coccodes определялось при пороговом цикле 20–27, тогда как остальные виды определялись после 40 циклов или не детектировались. Тест-система позволяет уверенно детектировать в анализируемой ПЦР-смеси концентрации ДНК C. coccodes, превышающие 0.01 нг/мм3. С помощью разработанной тест-системы было исследовано присутствие C. coccodes в листьях томата с симптомами поражения грибными болезнями и в клубнях картофеля без внешних симптомов заболевания. Листья с симптомами грибного поражения были собраны с двух разных полей в Краснодарском крае, клубни – с полей в Костромской, Московской, Калужской, Нижегородской областях. В Краснодарском крае был обнаружен один лист томата, содержащий ДНК C. coccodes; достоверное присутствие ДНК этого патогена было выявлено в 5 образцах клубней, выращенных в Костромской, Московской, Калужской областях.

Введение

Грибы рода Colletotrichum – опасные фитопатогены, поражающие зерновые, овощные культуры, травы, многолетние плодовые и ягодные растения. Один из повсеместно распространенных видов этого рода, Colletotrichum coccodes (Wallr).

Hughes, является возбудителем антракноза и черной пятнистости картофеля и томата, вызывает заболевания и ряда других растений семейства пасленовые, в т.ч. сорных (Dillard, 1992). C. coccodes поражает все подземные части растения, основания стеблей, листья и плоды (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). На кожуре инфицированных клубней картофеля наблюдается развитие серых пятен с нечетко выраженными краями, на которых хорошо видны черные точки спороношения и микросклероциев. В процессе хранения в мякоти клубней могут образоваться язвы с размягченным содержимым, т.е. болезнь переходит в фазу антракноза, что, однако, наблюдается крайне редко.

В то же время симптомы антракноза (язвы, покрытые кожурой с мелкими черными точками) типичны на плодах томата. На листьях симптомы поражения С. сoccodes выглядят как пятна темно- коричневого цвета, обычно окаймленные тканью желтого цвета (Johnson, 1994).

Развитие черной пятнистости на клубнях портит их внешний вид, что особенно выражено при продаже мытого картофеля краснокожурных сортов. Расслоение кожуры приводит к избыточному испарению и увеличению потерь при хранении (Hunger, McIntyre, 1979). Поражение других органов растений приводит к потерям урожая, что отмечалось в условиях как открытого, так и закрытого грунта (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Заболевания, вызываемые C. coccodes, распространены практически во всех картофелепроизводящих регионах мира, в том числе и в России (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Контроль этих заболеваний затруднен из-за недостаточной эффективности существующих фунгицидов в отношении C. Coccodes и отсутствия устойчивых сортов (Read, Hide, 1995).

Инокулюм C. coccodes может сохраняться в семенных клубнях (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), семенах томата (Ben-Daniel et al., 2010), выживать продолжительное время в почве, на растительных остатках (Dillard, 1990; Dillard, Cobb, 1993) и в сорных растениях (Raid, Pennypacker, 1987). Работами ряда авторов (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) показано, что развитие заболевания на картофеле и томате в значительной степени зависит от присутствия инокулюма в семенном материале и в почве. Поэтому для минимизации потерь от заболевания необходима диагностика (в том числе количественная) пропагул гриба в семенном материале, в почве, в закладываемых на хранение семенных клубнях картофеля и семенах томата. Морфологическая диагностика в почве и растительном материале может проводиться только по присутствию микросклероциев, которые, однако, встречаются и у других видов грибов.

Симптомы на клубнях очень похожи на серебристую паршу, вызываемую грибом Helminthosporium solani. Выделение Colletotrichum coccodes и Helminthosporium solani в чистую культуру довольно сложно и занимает продолжительное время в связи с медленным ростом на питательной среде. Для быстрого выявления Colletotrichum coccodes необходимо использование инструментальных методов диагностики. Наиболее удобным методом является полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее модификация – ПЦР в реальном времени. В настоящее время в странах Европы и США используется тест-система, разработанная английскими исследователями (Cullen et al., 2002) к ITS1 участку рДНК. Ее использование показало хорошие результаты и при анализе российских изолятов (Belov et al, 2018). Однако C. coccodes обладает высокой изменчивостью и его выявление по одной последовательности ДНК может привести к ложноотрицательным результатам. Для большей достоверности диагностики необходим анализ по нескольким видоспецифичным последовательностям ДНК, в связи с чем нами была разработана оригинальная тест-система, позволяющая идентифицировать C. coccodes по последовательности гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Материалы и методы

Для оценки эффективности и специфичности созданных тест-систем были использованы чистые культуры 15 видов грибов, выделенных авторами из пораженных образцов листьев и плодов томата, клубней картофеля (табл. 1). Для выделения брали органы растений с симптомами грибного поражения, не более одного органа с куста.

Срез клубня с кожурой, ломтик плода томата, пораженный лист помещали под бинокулярный микроскоп, после чего остро заточенной препаровальной иглой мицелий, споры или кусочек ткани переносили на агаризованную среду (сусло-агар) в чашке Петри. Хранили изоляты на скошенной агаризованной среде в пробирках при 4°С.

Предназначенные для анализа образцы листьев томата с симптомами поражения грибными болезнями сразу после сбора (на поле) помещали в 70%-й этиловый спирт в котором и хранили до выделения ДНК. Клубни картофеля доставляли в лабораторию, с них снимали кожуру (кусочек 2 × 1 см) и замораживали на –20°С. В замороженном состоянии хранили до выделения ДНК.

Чистые культуры грибов для выделения ДНК выращивали в жидкой гороховой среде. Мицелий гриба извлекали из жидкой среды, подсушивали на фильтровальной бумаге, замораживали в жидком азоте, гомогенизировали, инкубировали в СТАВ-буфере, очищали хлороформом, осаждали смесью изопропанола и 0.5М ацетата калия, 2 раза промывали 70%-м спиртом. Полученную ДНК растворяли в деионизированной воде и хранили при –20°С (Kutuzova et al., 2017). Концентрацию ДНК измеряли с использованием набора HS DNA quantification kit для двухцепочечной ДНК на Qubit 3.0 (Qiagen, Германия). Заспиртованные и замороженные образцы растирали в жидком азоте, далее проводили выделение ДНК аналогично описанному выше (для мицелия чистых культур грибов).

Таблица 1. Происхождение использованных в работе штаммов грибов

ПЦР проводили на амплификаторе DTprime (ДНК-Технология). Для проведения ПЦР использовали оригинальные праймеры и зонд на видоспецифичный участок гена глицеролтрифосфат-дегидрогеназы: прямой праймер Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, обратный праймер Coc280gdr – TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGA, зонд Cocgdz – (BHQ1)-AGTGTGCTTGAGA-(FAMdT)-GGGCTGCTGCCG(p). Праймеры амплифицируют участок размером 213 пн.

В реакцию брали 50 нг тотальной ДНК (при анализе листьев и клубней) и 10 нг (при анализе ДНК чистых культур грибов). Реакционная смесь (35 мкл) разделялась парафиновой прослойкой на две части: нижняя (20 мкл) содержала 2 мкл 10× реакционного буфера (750 mМ Tris-HCl, рН 8.8; 200 mМ (NH4)2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween-20), 0.5 мМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 7 пмоль каждого праймера и 4 пмоль гидролизуемого флуоресцентного зонда; верхняя содержала1 мкл 10× буфера для ПЦР и 1 ед Taq-полимеразы.

Разделение смеси парафином позволяет длительно хранить пробирки при температуре 5°С и обеспечить горячий старт ПЦР после их прогрева в течение 10 мин при температуре выше 80°С. ПЦР проводили по следующей программе: 94.0°C – 90 с (1 цикл); 94.0°C – 30 с; 64.0°C – 15 с (5 цик-лов); 94.0°C – 10 с; 64.0°C – 15 с (45 циклов); 10.0°C – хранение.

Результаты и обсуждение

Последовательности гена глицеролтрифосфатдегидрогеназы были определены у 45 штаммов, выделенных из листьев, стеблей, клубней картофеля и плодов томата (Kutuzova, 2018) в разных регионах России. Исследованные последовательности всех штаммов разделились на 2 группы, различающиеся двумя нуклеотидами. В GenBank депонированы нуклеотидные последовательности представителей обеих групп за номерами KY496634 и KY496635.

Сконструированные на их основе праймеры coc70gdf, coc280gdr и зонд cocgdz проверяли с помощью программы BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) на всех имеющихся в базе GenBank последовательностях гена глицеролтрифосфатдегидрогеназы видов рода Colletotrichum и других организмов.

Участков ДНК других организмов, высоко гомологичных праймерам и зонду, обнаружено не было.

Чувствительность тест-системы проверяли с использованием проб с разными концентрациями ДНК C. coccodes, ДНК пораженного антракнозом листа картофеля (собран в 2017 г. в Марий Эл, сорт Ред Скарлетт), и кожуры клубней, пораженных черной пятнистостью (собраны в Костромской обл., сорт Ред Скарлетт, табл. 2). Для подтверждения присутствия ДНК в клубнях и в листе картофеля из них были выделены в чистые культуры штаммы C. coccodes.

Результаты анализа чувствительности тест-системы показывают, что с ее помощью можно успешно диагностировать наличие в образце ДНК C. coccodes при ее суммарном содержании в ПЦР-смеси более 0.05 нг. Этого вполне достаточно для детекции, поскольку в одном склероции содержится в среднем 0.131 нг, а в одной споре – около 0.04 нг ДНК (Cullen et al., 2002). Тест-система, разработанная английской группой (Cullen et al., 2002), показала сходную, чувствительность (пороговый цикл 34 при 0.05 нг ДНК и 37 при 0.005 нг).

Анализ природных образцов, содержащих C. coccodes во всех случаях позволил достоверно вы-явить его присутствие в пробе (табл. 2). Предложенный метод выделения ДНК также оказался применим для анализа природных растительных образцов.

Таблица 2. Определение чувствительности предложенной тест-системы идентификации Colletotrichum coccodes для ПЦР в реальном времени

Примечание. *В смеси продуктов ПЦР.

Проверка специфичности тест-системы проводилась на образцах ДНК, экстрагированной из 15 видов грибов. Все штаммы грибов были выделены авторами из пораженных и здоровых плодов и листьев томата, клубней картофеля; один штамм был выделен из корня пшеницы (табл. 1). Среди выделенных с поверхности плода есть и непатогенные для томата виды (например, Phellinus ferrugineovelutinus).

Исследования показали, что ДНК C. coccodes выявлялась при пороговом цикле 20–27, тогда как остальные виды грибов не детектировались или давали сигнал после 40 цикла, что можно отнести к неспецифическому шумовому эффекту (табл. 3).

Таблица 3. Проверка тест-системы на грибах различных видов

Примечание. *Количество ДНК во всех пробах было 10 нг.

Разработанная тест-система была использована для идентификации C. coccodes в образцах листьев томата с симптомами поражения некротрофными патогенами и клубней семенного картофеля без видимых симптомов. Для исследования были взяты семенные клубни разных сор-тов, выращенных в Костромской, Московской, Калужской, Нижегородской областях. Достоверным присутствие ДНК C. coccodes считали в образцах, при анализе которых пороговый цикл не превышал значения 35. Это пороговое значение было выбрано исходя из достоверного определения 0.05 нг ДНК C. coccodes (пороговый цикл 33.5, табл. 2) и того факта, что при пороговых циклах выше 40 диагностировалась неспецифическая ДНК некоторых других видов грибов. При таком подходе достоверное присутствие ДНК C. coccodes было выявлено в 5 образцах клубней, выращенных в Костромской, Московской, Калужской областях и в одном листе томата из Ейского р-на Краснодарского края (табл. 4, 5).

Таблица 4. Детекция Colletotrichum coccodes на клубнях картофеля*

Примечание. *Количество ДНК во всех пробах было 50 нг.

Таблица 5. Детекция Colletotrichum coccodes на листьях томата*

*Количество ДНК во всех пробах было 50 нг.

Созданная нами тест-система не уступает разработанной английскими исследователями (Cullen et al., 2002) по чувствительности и специфичности и подходит для анализа растительных образцов. Ее применение для анализа семенных клубней позволило выявить ДНК C. coccodes у клубней без внешних признаков поражения и успешно провести анализ зараженности листьев.

В России до настоящего времени не проводили анализа клубней картофеля на пораженность C. coccodes. Наше впервые проведенное исследование показало, что из 16 протестированных семенных клубней, выращенных в разных регионах РФ, 5 содержат C. coccodes. Это показывает, что черная пятнистость клубней картофеля – обычное заболевание картофеля в России, и его роль в снижении объема и качества урожая картофеля недооценена.

При анализе листьев томата достоверное присутствие ДНК C. coccodes выявлено в одном листе из Ейского р-на Краснодарского края. Ранее при обследовании полей томата на юге России с помощью британской тест-системы (Cullen et al., 2002) были выявлены листья, содержащие C. coccodes, причем на некоторых полях обнаружена высокая доля листьев, пораженных C. coccodes (Belov et al., 2018). В Краснодарском и Приморском краях, Московской области нами были обнаружены плоды томата, из которых удалось выделить чистые культуры C. coccodes. Возможно, на томате в России C. coccodes распространен значительно шире, чем считается сейчас, и его вредоносность также недооценена.

Таким образом, к настоящему времени накопилось достаточно информации о широком распространении C. coccodes на картофеле и томате.

Для лучшего понимания роли этого гриба в развитии болезней картофеля и томата необходим ши-рокий мониторинг распространенности его в России, изучение роли почвенной и семенной инфекции, роли черной пятнистости в потерях при хранении. Применение ПЦР-диагностики может существенно облегчить проведение этой работы, а одновременное применение обеих тест-систем позволит существенно увеличить точность анализа.

Работа поддержана грантом РНФ № 18-76-00009.

Статья опубликована в журнале «Микология и фитопатология» (том 54, №1, 2020 г.).